基因工程技术生产重组胶原蛋白的研究进展

　　胶原蛋白是一种生物高分子，它广泛存在于动物结缔组织中，约占体内蛋白总量的25%～30%，是哺乳动物体内分布最广、质量分数最多的功能性蛋白。由于其良好的生物活性、生物相容性以及生物降解性，它在生物医学、食品和化妆品等领域都有着广泛的应用[1]。胶原蛋白具有很强的稳定性，是当下生物医学、药剂学、工业化学及材料学等研究的热点之一。人源胶原蛋白的种类多且结构复杂，据统计，已经发现并且得到确认的共有30种以上的胶原蛋白，其中占比较多、研究较为透彻的是Ⅰ型、Ⅱ型以及Ⅲ型胶原 蛋白[2]。从动物组织提取胶原蛋白成分虽然已有很长历史，但是工艺复杂且单体分离较难，还可能携带病毒存在安全隐患，其产量较低不能满足人们对胶原蛋白的巨大需求。相比之下，利用基因工程技术生产胶原蛋白具有提取法不具备的优点，产品稳定性及安全性高。因此，该技术近年来发展迅速，已经成功地进行了商化业开发与生产，各类相关研究也日趋深入。

　　1 胶原蛋白的结构

　　胶原蛋白 由 原 胶 原 组 成，每 个 原 胶 原 都 有 一种特殊的 三 重 螺 旋 结 构，由 3 条 α-螺 旋 的 肽 链 缠绕而成，长度约为1000个氨基酸残基;每条 α肽链通过左手螺旋缠绕，3条肽链一起形成一个大的右手螺旋结构(图 1)。胶 原 特 有 的 左 旋 α链 相 互缠绕构成胶 原 的 右 手 复 合 螺 旋 结 构，这 一 区 段 称为螺旋区段，区段最大特征是氨基酸呈现(Gly-X-Y)n周期性排列，其中 X，Y 位置为脯氨酸(Pro)和羟脯氨酸(Hyp)的比例很高，约占25%，是各种蛋白质中含量 最 高 的;胶 原 蛋 白 中 存 在 的 羟 基 赖 氨酸(Hyl)在其他蛋白质中不存在。羟脯氨酸(Hyp)不是以现成 的 形 式 参 与 胶 原 的 生 物 合 成，而 是 从已经合成的胶原肽链中的脯氨酸经羟化酶作用转化来的。

　　2 重组鼠胶原蛋白

　　1997年，Fukuda等[3]成功地将鼠IV 型胶原α1链全克隆并转染到 CHO 细胞株进行表达，但所得胶原蛋白以单链状态居多，只有极少的三螺旋结构，大多数 单 链 交 联 成 不 规 则 的 高 级 结 构。1999 年，Werten等[4]在毕赤酵母(Pichiapastoris)表达系统中成功分泌表达了大鼠Ⅰ，Ⅲ型胶原蛋白基因片段，分子质 量 约 为 2.1×104 Da 的 片 段 表 达 量 高 达14.8g/L，但是没有三螺旋结构，也没有发生羟基化。2002年，Bruin等[5]将一段分子质量约 2.8× 104 Da的鼠Ⅰ型胶原α1链的螺旋结构区域克隆并转化 到 多 形 汉 逊 酵 母 (Hansenulapolymorpha)NCYC495中进行表达，由于酵母自身可以合成脯氨酸羟化酶(Prolyl4-hydroxylase，P4H)，对表达的胶原蛋白虽 然 具 有 一 定 的 羟 基 化 修 饰 能 力，但 是与天 然 胶 原 蛋 白 相 比，羟 基 化 并 不 充 分，仅 约65%。

　　3 重组人胶原蛋白

　　为了避免动物来源产品所带来的高风险和不确定性，以及能充分利用胶原蛋白和明胶的优良特性，许多研究人员利用基因工程的技术，选用各种宿主细胞，如转基因植物、转基因动物、昆虫细胞、细菌和酵母等生产重组人胶原蛋白和明胶，其产品安全性好、质量稳定，消除了传统提取方法存在的病毒隐患，同时也改善了胶原蛋白和明胶的亲水性及免疫排异性等问题。

　　3.1 动、植物表达重组人胶原蛋白Toman等[6]报 道 了 将 胶 原 蛋 白 基 因 片 段 和 αS1-乳腺酪蛋白特异性启动子基因片段转化小鼠，通过转基因鼠的分泌型乳腺生产全长的人I型原胶原(Procollagen)。鼠乳中三螺旋结构的可溶性同型三聚体质量浓度达到8mg/mL。该产量虽然较高，但是氨基酸分析显示其中的羟脯氨酸质量分数只有正常水 平 的 40% ～45%。推 测 乳 腺 上 皮 细 胞 中P4H 的水平是其羟基化的主要限速步骤，如果转入编码 P4H 的基因就可以大大降低这种限制。理论上共转化胶原蛋白和 P4H 对应基因的动物能够产生大量的作为重组胶原来源的乳汁，其中存在的安全隐患依旧没有消除。

　　3.2 微生物表达重组人胶原蛋白

　　3.2.1 国外研究人胶原蛋白进展1997年，Vuorela等[13]成功利用毕赤酵母表达了人Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ型胶原蛋白全序列。大量研究表明胶原蛋白与关键酶 P4H 在宿主细胞的共表达是一个较好的策略。与胶原蛋白共表达，不仅促进了宿主表达的 P4H 的亚基正确且高水平地组装成具有活性的四聚体，同时也使得胶原蛋白能够被 P4H 充分羟基化。研究表明：与胶原蛋白的共表达还能显著提高 P4H 的半衰期，例如与Ⅲ型胶原蛋白共表达，其半衰期可显著提高15倍;酵母共表达 P4H 得到的胶原蛋白能折叠成正确的空间结构，并能充分地被羟基化，并且表达量可达0.2～0.6g/L，但是不能够分泌表达出细胞，只能积累在细胞的内质网内腔。即使进一步尝试使用α-MF信号肽也只能够极少量地提高其分泌量，同时又会减少Ⅰ型胶原蛋白的表达总量。通过分析产物，得到各重组蛋白的4-羟脯氨酸质量分数与天然胶原蛋白一样，并且能在体外正确组装成胶原纤维。继续对Ⅰ型胶原蛋白进行研究，将肽链的 N 末端基因切除，利用先前的方法构建重组酵母。结果表明：重组酵母表达得到的胶原分子其结构、性质等都接近于天然的胶原蛋白，同样也能在体外组装成胶原纤维，仅四基因的单拷贝重组子的胶原蛋白表达量就高达0.5g/L，比在同样条件下表达Ⅰ型胶原蛋白提高了1.5～3倍。

　　3.2.2 国内研究人胶原蛋白进展范代娣等[17]采用 PCR 技术获得人胶原蛋白基因片段，进行拼接重组后转化大肠杆菌，通过高密度发酵方式 培 养 生 产 类 人 胶 原 蛋 白，其 表 达 量 达 到29.4%，并进行了发酵条件和纯化等多方面的研究。为了获得不含 N 和 C 末端肽的单链全长人胶原α1(Ⅲ)链(COL3A1)的高水平分泌表达，研究人员将人 COL3A1对应基因的cDNA 克隆到毕赤酵母分泌表达载体 pPIC9K 中，并整合到毕赤酵母 GS115中[18]。SDS-PAGE和蛋白质印迹分析表明：未水解的重组 人 COL3A1(rhCOL3A1)被 分 泌 到 培 养 基中，并显示出约130kDa的表观分子质量，这比理论值高1.4 倍。最 后，使 用 四 步 方 法 将 未 羟 基 化的rhCOL3A1纯化至高于 90% 的 纯 度。此 外，甲基噻唑基二苯基四氮唑溴化物实验表明低浓度的rhCOL3A1能 有 效 促 进 幼 仓 鼠 肾 细 胞 (BHK21)增殖。

　　唐云平等[25]通过在大肠杆菌中将类人胶原蛋白基因 与 人 脯 氨 酰-4-羟 化 酶(P4H)和 D-阿 拉 伯-1，4-内酯氧化 酶 (ALO)共 表 达，构 建 了 一 个 原 核表达系统来 生 产 羟 基 化 类 人 胶 原 蛋 白，并 且 研 究了5种不同的培养基以及诱导条件对该蛋白可溶性表达的影响。结果表明：当重组细胞在 MBL培养基中生 长 并 在 指 数 生 长 期 中 期 由 0.1 mmol/LIPTG 诱导时，摇瓶获得的目标类人胶原蛋白的最高可溶性表达水平为(49.55±0.36)mg/L。采用葡萄糖补料策略，在 10L 的 台 式 发 酵 罐 中，目 标类人胶 原 蛋 白 的 表 达 水 平 可 提 高 到 260 mg/L。此 外，高 效 液 相 色 谱 分 析 显 示：在 纯 化 的 类 人 胶原蛋 白 中，超 过 10% 的 脯 氨 酸 残 基 被 成 功 羟基化。

　　4 结 论

　　胶原蛋白由于其良好的生物相容性、降解性及其他生物活性，越来越受到人们的关注，通过基因工程生产胶原蛋白的方法也由于其安全性高、产量高和成本低等优势，逐渐成为研究热点。国内外胶原蛋白的需求量正稳步增长，尤其是高质量的胶原蛋白，其产品市场前景广阔。因此，有关基因工程技术生产重组胶原蛋白的研究也在不断向前推进。利用重组技术生产胶原蛋白虽然已经取得了长足的进步，但是目前制备的重组胶原蛋白的产量、结构特性及纯度仍有提升空间。

　　参考文献：

　　[1] 齐晓玲，李贺先，王国昌，等.生物活性胶原蛋白及明胶形态的表征研究[J].离子交换与吸附，2010，26(1)：53-58.

　　[2] 米钰，惠俊峰，范代娣，等.类人胶原蛋白生物相容性实验研究[J].西北大学学报(自然科学版)，2004(1)：66-68.

　　[3] FUKUDA K，HORIH，UTANIA，etal.Formationofre-combinanttriple-helical[alpha1(Ⅳ)](2)alpha2(Ⅳ)collagenmoleculesinCHO coils[J].Biochemicalandbiophysicalre-searchcommunications，1997，231(1)：178-182

　　《基因工程技术生产重组胶原蛋白的研究进展》来源：《发酵科技通讯》，作者：魏 春1，刘 春1，刘心雨1，张旭初2，王 欢2

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