农业研究论文灵芝发酵豆渣培养条件优化

　　据统计，中国每年豆渣产量在2000万t左右，如此大量的豆渣利用是一个难题[1]。研究表明，干豆渣中含20%左右的蛋白质，50%左右的膳食纤维素，10%左右的脂肪，以及丰富的钙、磷等矿物质元素和维生素，其中含有的膳食纤维素已被称为第七种营养素，可以预防结肠癌、胆结石、降低胆固醇、预防由冠状动脉硬化引起的心脏病，降低糖尿病人的血糖水平，是一种优质的保健食品原料，同时，豆渣来源广泛，价格低，开发保健食品具有广泛的应用前景[2，3]。为此，以豆渣为固体培养基培养灵芝，研究最佳发酵条件，为豆制品加工副产物利用提供理论依据。

　　摘要：为了提高豆渣附加值，以豆渣为基质固体发酵赤灵芝[Ganodermalucidum（Curtis∶Fr）P.Karst]，通过单因素试验研究了发酵时间、接种量、培养温度及蔗糖添加量对灵芝菌丝生长和发酵豆渣多糖含量的影响，并用正交试验优化了发酵条件。结果表明，蔗糖添加量1.0%、接种量12%、培养时间12d、培养温度27℃条件下发酵豆渣多糖含量最高。

　　关键词：赤灵芝[Ganodermalucidum（Curtis∶Fr）P.Karst],豆渣,多糖,培养条件,农业研究论文

　　1材料与方法

　　1.1材料

　　赤灵芝菌种，购于华中农业大学食用菌研究中心。豆渣，市售。

　　1.2方法

　　1.2.1培养基的制备固体培养基：PAD培养基（土豆200g，葡萄糖20g，蛋白胨5g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O0.5g，琼脂17g，去离子水1000mL），分装于试管，121℃灭菌20min，摆斜面，备用。

　　液体培养基：PAD培养基（土豆200g，葡萄糖20g，蛋白胨5g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O0.5g，去离子水1000mL），分装于250mL三角瓶内，120mL/瓶，121℃灭菌20min，备用。

　　1.2.2菌种的制备

　　1）菌种活化。在无菌条件下，从原始菌种斜面上挑取0.3cm×0.3cm大小菌块，转接至斜面培养基，置于培养箱中30℃培养5～7d，菌丝长满斜面后备用。

　　2）液体种子的制备。在液体培养基中接入3块黄豆粒大小的赤灵芝活化菌种，于150r/min旋转式摇床30℃培养5d，备用。

　　3）赤灵芝发酵豆渣工艺流程。新鲜豆渣→复配→灭菌→冷却→接种→发酵。将50g豆渣装入100mL的三角瓶中，压实，121℃下灭菌20min，冷却后无菌条件下接种。

　　1.2.3豆渣发酵条件的优化

　　1）豆渣发酵条件的单因素试验。①蔗糖添加量对豆渣发酵品质的影响试验。分别称取0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00g蔗糖，加入50g鲜豆渣中，混匀，即蔗糖添加量分别为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%，控制温度27℃，接种量8%，培养10d，通过感官评价及多糖含量确定豆渣发酵的最佳蔗糖添加量；②接种量对豆渣发酵品质的影响试验。吸取1、2、3、4、5、6mL的菌液于灭过菌的豆渣培养基中，即接种量分别为2%、4%、6%、8%、10%、12%，培养温度27℃，蔗糖添加量2%，培养10d，通过感官评价及多糖含量确定豆渣发酵的最佳接种量。③培养温度对豆渣发酵品质的影响试验。在蔗糖添加量2%，接种量8%，培养温度分别设定为21、24、27、30、33℃的培养箱中培养，培养10d，通过感官评价及多糖含量确定豆渣发酵的最佳温度；④发酵时间对豆渣发酵品质的影响试验。蔗糖添加量2.0%，培养温度27℃，接种量为8%，发酵时间分别为4、6、8、10、12、14d，通过感官评价及多糖含量确定豆渣发酵的最佳接种量。

　　2）豆渣发酵最佳条件正交试验。试验根据单因素试验结果，每个因素选取3个水平，通过4因素3水平的正交试验（表1）分析比较发酵豆渣中多糖含量，确定最佳发酵条件。

　　1.2.4指标测定

　　1）发酵豆渣的感官评定方法。主要针对其外观、质地及风味3个方面属性进行评定（表2）。计算公式：感官评定得分=外观得分×0.4+质地得分×0.3+气味得分×0.3。

　　2）多糖含量测定。①葡萄糖标准曲线的制定。精密量取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL的100mg/L标准葡萄糖溶液分别置于15mL的试管中，加去离子水补足1.0mL，分别加入5%的苯酚1.0mL，然后快速加入5.0mL硫酸（与液面垂直加入，勿接触试管壁，以便与反应液充分混合），静置10min。使用涡旋振荡器使反应液充分混合，然后将试管置于30℃环境中反应20min，在490nm波长处测吸光度。以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，制作标准曲线（图1）。②样品测定。称量样品5g，精确到0.001g，置于100mL的三角瓶内，第一次提取料液比为1∶6（m/V，g∶mL，下同），提取2h，离心分离后再按料液比1∶4加入去离子水提取2h，合并两次提取液。吸取提取液0.5mL加入3倍体积的95%的乙醇混合，静置过夜以沉淀粗多糖，然后于10000r/min离心10min，弃去上清液。不溶物用1.5mL的去离子水洗涤溶解，待测。吸取0.1mL待测样品，按上述步骤操作，测A490nm，以标准曲线计算多糖含量。

　　2结果与分析

　　2.1单因素试验结果

　　2.1.1发酵条件对发酵豆渣感官质量的影响由图2可以看出，发酵温度、接种量、蔗糖添加量和培养时间对豆渣的发酵都有影响，发酵温度在27℃时灵芝菌丝粗壮细密，感官评价最好，温度过低菌丝生长速度慢，温度过高菌丝生长细弱，容易液化；接种量越大菌丝生长速度越快，但是接种量加大，发酵体系中水分含量和糖含量会增加，试验表明接种量为10%比较合适；蔗糖添加量对菌丝影响较大，添加0.50g蔗糖菌丝生长最好，随添加量增大，发酵豆渣感官评价值降低，可能与蔗糖增加发酵体系渗透压加大，不利于菌丝生长，再者，蔗糖添加量增大发酵体系酸碱度降低，从而不利于菌丝生长；培养时间对发酵豆渣也有影响，时间过短，豆渣发酵不充分。2.1.2蔗糖添加量对发酵豆渣多糖含量的影响由图3可知，蔗糖添加量对发酵豆渣多糖含量影响不大，不同处理豆渣多糖含量大多在8.00%～11.00%，各处理之间差异不显著，因此选择添加量为1.0%作为豆渣发酵优化试验添加量。

　　2.1.3接种量对发酵豆渣多糖含量的影响由图4可知，在接种量2%～8%时随接种量增加，发酵豆渣中多糖含量增大，继续增加接种量发酵豆渣中多糖含量趋于平稳，可能的原因是接种量低豆渣中灵芝菌丝体生长速度慢，发酵豆渣中纤维素分解速度也慢，多糖含量较低，随接种量增加，发酵豆渣培养基中灵芝菌丝生长速度增加，在接种量达10%左右时趋于平稳。

　　2.1.4温度对发酵豆渣多糖含量的影响由图5可知，培养温度对发酵豆渣中多糖含量影响较大，主要原因与发酵豆渣中灵芝菌丝有很大关系，培养温度低，菌丝生长速度慢，同时，高温会抑制灵芝菌丝的生长，与感官评价的结果比较一致。

　　2.1.5发酵时间对发酵豆渣多糖含量的影响由图6可知，随发酵时间延长，发酵豆渣中多糖含量总体呈先升高后降低的趋势，在接种后的8d发酵豆渣中多糖含量最高，然后降低，趋势与菌丝生长情况比较一致，4d时发酵时间短，菌丝未吃透，12d以后菌丝衰败，出现液化现象。

　　2.2豆渣发酵条件的优化

　　正交试验结果（表3）表明，影响发酵豆渣多糖含量的因素主次顺序依次为蔗糖添加量、培养温度、发酵时间、接种量，优化得到的豆渣发酵制备灵芝多糖最佳条件为蔗糖添加量1.0%，接种量12%，发酵时间12d，培养温度27℃，通过优化，发酵豆渣中多糖含量达10.41%，为未发酵前的1.9倍。

　　3讨论

　　豆渣是制备豆腐、豆浆等的副产物，每年的量都很大，据统计，每加工1kg大豆会产生2kg的豆渣，以此推断中国每年的豆渣产量在2000万t以上。豆渣因具有丰富的营养成分，所以鲜豆渣利用一直是世界难题[4，5]。豆渣中的营养物质的含量能够满足药用真菌的生长要求。丁玉萍等[6]以豆渣为主要原料，应用正交试验法对香菇液体发酵最佳培养基和发酵条件进行了研究，结果表明，香菇液体发酵最佳培养基配方为葡萄糖2%，MgSO40.05%，豆渣9%，KH2PO40.1%，并用洗渣水替代水配料；适宜的发酵条件为发酵时间6d，装液量250mL三角瓶装液80mL，发酵温度25℃。灵芝是公认的具有提高免疫力、抗肿瘤活性的药用真菌，其含有的灵芝多糖等物质具有安神、提高免疫力等作用[7]。传统获取灵芝多糖的方法是用灵芝子实体进行提取，提取过程需要消耗大量的热能和水，而提取率一般在2%以下，提取成本很高[7，8]。研究结果表明，采用豆渣发酵制备灵芝多糖是获取灵芝多糖的有效方法，发酵豆渣中多糖含量可达10%以上，而且具有豆渣原料便宜、发酵时间短等优点。发酵豆渣培养灵芝获得的多糖与灵芝子实体中多糖在结构和功能上的区别还需要进一步研究。

　　参考文献：

　　[1]孙艳辉，董英.响应面法优化以豆渣为基质发酵纳豆菌[J].食品科学，2007，28（4）：208-211.

　　[2]谢婧.豆渣发酵过程中主要营养保健成分变化规律的研究[D].长沙：湖南农业大学，2008.

　　[3]肖少香.豆渣发酵技术的研究[J].食品科技，2007（7）：72-75.

　　[4]朱运平.豆渣的营养功能特性[J].营养健康新观察，2006（2）：47-49.

　　[5]张振山，叶素萍.豆渣加工的处理与加工利用[J].食品科学，2004，25（10）：400-406.

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